Investigação dos efeitos do ácido etilmalônico sobre a atividade da acetilcolinesterase em cérebro de ratos

Abstract

O ácido etilmalônico (EMA) acumula-seem tecidose líquidosbiológicos de pacientes acometidos peladeficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCADD) epelaencefalopatia etilmalônica (EE), erros inatos do metabolismo (EIM) caracterizados por alterações neurológicas heterogêneas, incluindoatraso no desenvolvimento, deficiência intelectuale sintomas neuromusculares. No entanto, a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nesses pacientes ainda não é completamente conhecida. Oobjetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vivo, in vitroe in silicodo EMA sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE), enzima importante para finalização das sinapses colinérgicas,em córtex cerebral de ratos.Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos com 30 dias de vida. Para os experimentos in vivo, os animais foram divididos em dois grupos: grupo EMA, que recebeu 3 administrações subcutâneas do EMA(6μmol/g; 90 minutos de intervalo), e controle, que recebeu 3 administrações de solução salina nas mesmas condições.Uma hora após a última administração, os animais sofreram eutanásia por decapitação e os córtices cerebraisforam limpos e isolados para determinação da atividade e expressão da AChE. Para os experimentos in vitro, córtices cerebrais de animais sem prévia manipulação foram homogeneizados e incubados na presença de diferentes concentrações de EMA (0,5, 1 e 2,5 mM) por 1 h. Imediatamente após, os homogeneizados foram utilizados para a determinação da atividade da AChE.Inicialmente, foi observadoum aumento daatividade da enzima AChE no grupo que recebeu administraçõesde EMA em comparação ao grupo controle. O mesmo efeito foi observado in vitroapós uma hora de incubação na presença de EMA.Na tentativa de elucidar o mecanismo pelo qual o EMA ativa a AChE, foi avaliada a expressão desta enzima através da medida dos níveis de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm). Entretanto não houve nenhuma diferença significativa entre os grupos, indicando que este ácido orgânico não altera aexpressão desta enzima.Foram então investigados parâmetros in silicopara avaliar a interação do EMA com a AChE de Rattus norvegicus(rAChE), bem como a afinidade do seu substrato (acetilcolina; ACh)com arAChEpreviamente ligada ao EMA (halo-AChE) e na ausência de EMA (apo-AChE)por docagemmolecular.Adicionalmente, odetalhamento atômico intermolecular da docagem do EMA em rAChEevidenciou a formação de ligações de hidrogênio entre o EMA e os resíduos fenilalanina 295 e arginina 296 de rAChE a 2,4 Å e 2,6 Å de distância, respectivamente. Vale ressaltar que o resíduo fenilalanina 295 faz parte do sítio de ligação acil, que reconhece a entrada de moléculas na região catalítica. Também observou-se que a ACh se liga próximo à tríade catalítica da halo-AChE,e o valor de energia dessa ligação é mais negativo (-5,2 kcal/mol) quando comparado ao valor de energia de ligação da ACh àapo-AChE(-5,0 kcal/mol). Tomados em conjunto, os resultados do presente trabalho sugeremuma ativação da AChE causada pelo EMA, e tal efeito possivelmente se deve a um efeito alostérico. Tais alteraçõespodem colaborar para o dano cerebral e o dano cognitivoencontradosnos pacientes acometidos por SCADD e EE.

Ethylmalonic acid (EMA) accumulates in tissues and biological fluids of patients suffering from short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy (EE), diseases characterized by neurological alterations, includingdevelopmental delay, intellectual disability,and neuromuscular symptoms. However, the pathophysiology ofbrain dysfunction in these patients is still uncertain. In this context, the aim of the present study was to investigate in vivo, in vitro, and in silicoeffects ofEMA on acetylcholinesterase (AChE)activity, important enzyme for termination of cholinergic synapses, in cerebral cortex of30-day-old male Wistarrats. For in vivoexperiments, the animals were dividedinto two groups: EMA group, which received threesubcutaneous EMA administrations(5 μmol/g; 90 minutes of interval), and control group, which received three saline solution administrations in the same conditions.One hour after the last administration, the animals were euthanized by decapitation and the cerebral cortex of each animal werecleaned and isolated for analysis of AChE activity and its expression.For in vitroexperiments, cerebral cortex homogenates from animals without previous manipulation were incubated in the absence or presence of different concentrations of EMA(0.5, 1 and 2.5 mM)for 1 h. Immediately after, these homogenates were used for the determination of AChE activity.First, it was observed that EMA administrationincreased AChE activity when compared to control group.The same effect was observed in in vitroexperiment after one hour of incubation.In an attempt to elucidate the mechanisms by which EMA activated AChE, it was evaluated the expression of this enzyme by measuring messenger ribonucleic acid (mRNA) levels and it was not verified any difference between groups, indicating that EMA did not affect AChE expression.In order to evaluate the interaction between EMA and AChE from Rattus norvegicus(rAChE), as well as the affinity between acetylcholine (ACh) and rAChE previously bonded to EMA (halo-AChE) and in the absence of EMA, it was carried out in silicoexperiments by molecular docking. It is noteworthy that phenilalanine 295 is part of acyl binding, that recognizes the entrance of molecules within the gorge. Additionaly, the atomic intermolecular detail fromEMA docking within rAChE showed hydrogen bonds between EMA and phenylalanine 295 and arginine 296 residues from rAChE, with 2.4 Å and 2.6 Å of distances, respectively. It was also observed that ACh bonded near the catalytic triad of rAChE in halo-AChE andthat the energy value of this affinity is more negative (-5.2 kcal/mol) when compared to the affinity from ACh within apo-AChE (-5.0 kcal/mol). Taken together, the present results suggest an activation of AChE caused by EMA andthatthis effect is possible due to an allosteric effect. These alterations might collaborate to the brain damage and intellectual disability found in patients affected by SCADD and EE.